同田專利CN1264822C_一種高純度石杉堿甲的制備方法

專利基本信息

說明書

一種高純度石杉堿甲的制備方法

技術領域

本發明涉及采用高速逆流色譜法(HSCCC)從石杉屬植物千層塔中制備天然生物堿的方法，特別是一種高純度石杉堿甲的制備方法。

背景技術

隨著社會人口的老齡化，老年性癡呆癥發病率相對上升，目前65歲以上的癡呆癥患病率為5％～10％，而且仍在增長之中。據統計，當今世界有5000多萬老年人患有不同程度的老年性癡呆癥。我國60歲以上人口預計到2010年將占總人口的15.7％，癡呆癥問題同樣是我們所面臨的不可回避的問題。因此尋找治療老年性癡呆病的有效藥物己受到各國的高度重視，成為當務之急。老年癡呆病中50％～60％為阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)，它是一種以記憶力喪失和認知功能障礙為主要特點的原發性灰質腦病。臨床表現為進行性癡呆，其病因尚不明確，假說有多種，如神經遞質缺陷、炎癥、自由基損傷、淀粉樣蛋白、神經毒作用、激素缺乏、細胞凋亡等。治療AD的目的是改善認知功能障礙，提高病人的生活能力。70年代，研究主要集中在乙酰膽堿與AD的關系；80年代，主要是研究膽堿酯酶抑制劑對AD的影響；90年代，研究不僅有乙酰膽堿受體激動劑，還包括了雌激素、消炎藥、影響自由基代謝的藥物及抑制淀粉樣蛋白沉積的藥物。但由于種種原因，到目前為止，AD的臨床治療仍然是一個有待攻破的世界性難題。近年來，國內外學者在應用天然藥物有效成分治療老年癡呆病方面做了大量的基礎研究和臨床應用研究，由于腦中膽堿能系統與人的學習、記憶功能是密切相關的。早期的研究發現AD病人的腦膽堿能系統受到了損害，導致突觸部位乙酰膽堿含量的下降，從而對病人的學習、記憶能力產生影響。因此，針對提高AD病人腦中的乙酰膽堿含量，促進膽堿能神經功能的藥物應運而生?，F在這類藥物的研究集中于膽堿酯酶抑制劑和毒蕈堿M1受體激動劑。石杉堿甲(huperzine A)為我國首創的可逆性強效乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑，是近年來從石杉屬植物千層塔Huperzia serrata(Thunb.)Tre v.中分離到的一種新的生物堿。目前進行的臨床研究表明它在膽堿能神經突觸處對AChE的抑制作用強于他克林(tacrine)。動物行為學研究顯示石杉堿甲可提高動物的學習和記憶能力，治療指數高于他克林、毒扁豆堿和加蘭他敏。在臨床為期8周的雙盲試驗中，口服0.2mg/d，每日2次，有58％的病人顯著改善了所有被測記憶、認知和行為能力參數P＜0.05，且未出現嚴重的反應，因此石杉堿甲是一種很有發展前途的治療AD的藥物。對老年性癡呆癥，單純記憶障礙以及重癥肌無力癥治療有顯著療效，且藥效持續時間長，無嚴重不良反應，是國內外上述病癥最有效的藥物，深受關注，國內已批準上市。在國際上已被列為第二代膽堿酯酶的抑制劑之一。

石杉堿甲的結構式如下：化學名稱為(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氫-7-甲基-5，9-甲撐環辛并(b)吡啶-2(1H)酮石杉堿甲(Hup A)在自然界中存在量極低，且含有大量雜質，至今國內外有大量研究人員正在探索尋找理想的分離辦法。曾有人利用溶劑萃取、硅膠柱層析等方法進行分離，雖然能獲得少量產品，但終因費時，得率低而難于規?；a。而人工合成品難于獲得理想的療效。逆流色譜分離制備方法可以達到純度高，得率高而優于傳統的柱色譜等分離方法。高速逆流色譜技術(High-SpeedCountercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年發展起來的一種連續的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術，其原理是利用螺旋柱在行星運動時產生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時保留其中的一相(固體相)，利用恒流泵連續輸入另一相(流動相)，隨流動相進入螺旋柱的溶質在兩相之間反復分配，按分配系數的次序，被依次洗脫。在流動相中分配比例大的先被洗脫，反之，在固體相中分配比例大的后被洗脫。它避免了固態支持體或載體帶來的各種問題——樣品容易被吸附、損耗和變性，使其它液相色譜技術進行制備量分離時，其分配效率會明顯降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰型分辨度，分離量大、樣品無損耗、回收率高、分離環境緩和，節約溶劑。高速逆流色譜儀能直接進大量粗提物樣品或合成混合物，分離結果能夠達到相當高的純度，甚至能直接接質譜儀等儀器，已廣泛應用于生物、醫藥、環保等領域化學物質的制備分離和純化。因此，HSCCC具有操作簡便，理論回收率為100％，重現性好和分離效率高、分離量較大的特點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服傳統分離技術的缺陷，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，提供一種高純度石杉堿甲的制備方法。該方法具有回收率高，分離量大和操作簡便的優點。

本發明的技術方案包括如下步驟：采用高速逆流色譜制備方法，它包括制備構成固體相，流動相的溶劑體系：先用固定相存滿逆流色譜儀柱子，調節主機轉速，將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；根據監測器紫外圖譜接收目標成分。首先選擇一個溶劑體系的兩相組合，溶劑體系由三個組分構成，A組分可選自正庚烷、正己烷、正戊烷等正構烷烴，B組分可選自甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮，C組分為水，優先選擇正己烷-正丁醇-水體系。

根據溶解度常數，在不破壞體系平衡的情況下，調節A，B，C，三組分的體積比依次為：1-5∶0.1-2∶1-5。例如2∶1∶2；5∶1∶4；20∶8∶20等；上述體系上相為固定相，下相為流動相。且經一次分離得到石杉堿純品，純度在99％以上。

實驗條件適合溫度20-30℃，在上述溫度范圍內，溫度較高時，出峰時間略有提前，分離效率變化不大，對峰形無多大影響。

主機轉速和流速需控制在一定范圍內，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相和下相分開，采用TBE-300A高速逆流色譜儀，該機型柱體積為300ml，進樣圈為20ml，配有AKTA Prime泵，監測器和記錄儀。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速為600-1000rpm，以0.5-4mL/min的流速將流動相泵入柱內。

由于石杉堿甲的不穩定性，分離和收集到的目標成分，馬上餾分濃縮蒸干進行結晶得到單體。

本發明方法采用了高速逆流色譜分離技術，是一種連續的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術，它克服了固態支持體或載體不可逆吸附、損耗和變性，使被分離物回收率高，理論達100％，本發明實際達到95％以上。又因為采用優選的溶劑體系，控制實驗條件溫度、調整主機轉速和流速的工藝條件，可以高效率的分離，獲得高純度石杉堿甲單體(達到99％以上)。本發明方法適合從各種工藝途徑制備的不同含量石杉堿甲粗品中分離制備高純度的石杉堿甲單體。使用于用各種型號的逆流色譜儀分離制備石杉堿甲單體，能直接進大量粗提樣品或合成混合物，分離結果能達到相當高的純度，保證較高峰型分辨度，分離量大、回收率高、分離環境緩和，節約溶劑，操作簡便。

具體實施方式

實施例1選取正己烷-正丁醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。先按5∶1∶5體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為200ml，AKTA Prime泵、檢測器和記錄儀。稱取200mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速為950rpm，以3.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進行結晶，其HPLC純度達到99％左右。

實施例2選取正已烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實驗條件適合溫度25℃，先按2∶1∶4體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為200ml，AKTA Prime泵、檢測器和記錄儀。稱取150mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速為750rpm，以4.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進行結晶，其HPLC純度達到99％左右。

實施例3選取正已烷-乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實驗條件適合溫度30℃，先按2∶1∶4體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為200ml，AKTA Prime泵、檢測器和記錄儀。稱取150mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速為750rpm，以4.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進行結晶，其HPLC純度達到99％左右。

實施例4選取正庚烷-丙酮-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實驗條件適合溫度22℃，先按4∶1∶3體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為200ml，AKTA Prime泵、檢測器和記錄儀。稱取150mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速為650rpm，以3.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進行結晶，其HPLC純度達到99％左右。

實施例5選取正戊烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實驗條件適合溫度20℃，先按2∶1∶1體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為200ml，AKTA Prime泵、檢測器和記錄儀。稱取180mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進樣前，先用固定相存滿整個柱子，調整主機轉速為1000rpm，以3.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進行結晶，其HPLC純度達到99％左右。