同田專利CN101392016A_一種高純度大豆皂苷A和B的制備方法

專利基本信息

說明書

一種高純度大豆皂苷A和B的制備方法

[0001] 技術領域

[0002] 本發明屬大豆皂苷的制備領域，特別是涉及一種高速逆流色譜制備高純度大豆皂苷A和B的方法。

[0003] 背景技術

[0004] 大豆營養成分十分豐富，除用于制作食用油和飼料外，還可制成豆腐、豆乳、發酵食品等大豆食品而被廣泛食用。中、日、韓等東亞各國食用大豆食品的歷史悠久。近年來流行病學研究發現，與歐美人相比，東亞各國的婦女更年期癥狀較為輕微，骨質疏松發病率較低，乳腺癌，前列腺癌等癌癥以及心肌梗塞、動脈硬化等心血管疾病的發病率與死亡率也較低。據認為，這與該地區人的飲食習慣，尤其是與日常飲食中攝入的大豆食品較多有很大關系。因而，引發了研究與開發含有大豆成分的保健功能食品的熱潮。大豆中的主要有效成分有：(1)大豆蛋白與大豆肽類；(2)大豆異黃酮類：現已確認的有12種，主要以3種異黃酮苷元(染料木黃酮、黃豆苷元和苷氨苷元)和它們的糖甙的形式存在；(3)大豆卵磷脂類：磷脂酰膽堿(PC)，磷脂酰絲氨酸(PS)，磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰乙醇胺(PE)；(4)大豆皂苷類：其分子是由低聚糖及齊墩果稀三萜縮合形成的一類化合物。目前使用化學法研究大豆皂苷，確認大豆皂苷元有5個種類，即大豆皂苷元A、大豆皂苷元B、大豆皂苷元C、大豆皂苷元D、大豆皂苷元E。日本學者北川勛和大久保一良對多種豆類中的大豆皂苷進行了分析，認為在完整的皂苷中，天然存在的大豆皂苷有3種，即大豆皂苷元A、大豆皂苷元B、大豆皂苷元E，其它的為DDMP組，均為水解狀態下的人工產物。

[0005] 大豆皂苷A的結構式如下：

[0006]

[0007] R1＝CH2OH   R2＝β-D-GLc   R3＝H

[0008] 大豆皂苷B的結構式如下：

[0009]

[0010] 大豆皂苷是皂苷研究中起步較晚的一類，大豆皂苷具有明顯的溶血作用，對人體健康不利，被視為抗營養因子，同時它具有苦味，導致大豆制品具有苦澀味。因此在豆類食品加工中總被設法除去。但近年研究表明，大豆皂苷的毒副作用很小，且具有許多對人體有益的生理功效。它可降低血中膽固醇和甘油三脂含量，可預防高脂肪膳食所造成的高脂血癥，大豆皂苷通過增加SOD的含量，清除自由基，具有抗氧化和降低過氧化脂質的作用，大豆皂苷具有抑制腫瘤細胞生長的作用，可抑制血小板減少和凝血酶引起的血栓纖維蛋白形成，具有抗血栓作用。據報道，大豆皂苷對人類艾滋病毒的感染有一定的抑制作用，同時還表現出對病毒感染的細胞有很強的保護作用，正是由于大豆皂苷的這些重要的生理作用，決定了它在藥物方面應用的廣泛前景，國外報道，大豆皂苷最有可能被開發為治療心血管疾病的藥物。

[0011] 由于大豆皂苷是極性高的酸性皂苷，為復雜的化合組分，所以純大豆皂苷的分離提取比較困難。目前，工業上還沒有大批生產，常規實驗室提取方法也很難得到純度較高的大豆皂苷單體。

[0012] 高速逆流色譜技術(High-SpeedCountercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年發展起來的一種連續的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術，其原理是利用螺旋柱在行星運動時產生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時保留其中的一相(固體相)，利用恒流泵連續輸入另一相(流動相)，隨流動相進入螺旋柱的溶質在兩相之間反復分配，按分配系數的次序，被依次洗脫。在流動相中分配比例大的先被洗脫，反之，在固體相中分配比例大的后被洗脫。它避免了固態支持體或載體帶來的各種問題，如樣品容易被吸附、損耗和變性，使其他液相色譜技術進行制備量分離時，其分配效率會明顯降低，溶劑消耗量大?，F在已廣泛應用于生物、醫藥、環保等領域化學物質的制備分離和純化，使其成為制備高純度大豆皂苷A和大豆皂苷B的較佳手段。

[0013] 發明內容

[0014] 本發明要解決的技術問題是提供高速逆流色譜制備高純度大豆皂苷A和大豆皂苷B的方法。本發明制得的大豆皂苷A和大豆皂苷B純度高，該方法具有回收率高，分離量大和操作簡便的特點。

[0015] 本發明的一種高速逆流色譜制備高純度大豆皂苷A和B的方法，包括：

[0016] (1)選擇上相為固定相，下相為流動相的溶劑體系，該溶劑體系由A、B、C和D四個組分構成：A組分為乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丁酯；B組分為正丙醇或正丁醇；C組分為乙醇、甲醇；D組分為水，將四組份按體積比1～5：0.5～1：1～5：5～10，將其置于分液漏斗中，搖勻靜置分層，待平衡20—40分鐘后，將上相和下相分開，即得該溶劑體系；

[0017] (2)先用固定相充滿逆流色譜儀柱子，調節主機轉速為600—1000rpm，將流動相以0.5—4ml/min的流速泵入柱內；

[0018] (3)待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣；

[0019] (4)根據檢測器紫外圖譜接收目標成分，將流分進行濃縮凍干結晶后，得到大豆皂苷單體A和大豆皂苷B的單體。

[0020] 優選的溶劑體系為乙酸乙酯—正丁醇—乙醇—水體系。

[0021] 所述步驟(1)和(2)中的溶劑體系為乙酸甲酯—正丙醇—乙醇—水，該四組分的體積比依次為：4：0.8：2：6，主機轉速950rpm，流動相泵入柱內的流速為3.0ml/min。

[0022] 所述步驟(1)和(2)中的溶劑體系為乙酸乙酯—正丁醇—乙醇—水，該四組分的體積比依次為：3：0.5：1：8，主機轉速650rpm，流動相泵入柱內的流速為3.0ml/min。

[0023] 所述步驟(1)和(2)中的溶劑體系為乙酸丁酯—正丁醇—甲醇—水，該四組分的體積比依次為：4：1：1：6，主機轉速750rpm，流動相泵入柱內的流速為4.0ml/min。

[0024] 所述步驟(1)和(2)中的溶劑體系為乙酸乙酯—正丙醇—甲醇—水，該四組分的體積比依次為：1：1：1：7，主機轉速850rpm，流動相泵入柱內的流速為5.0ml/min。

[0025] 本發明方法采用了高速逆流色譜分離技術，是一種連續的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術，它克服了固態支持物或載體不可逆吸附、損耗和變性，使被分離物回收率高，理論達100％，本發明實際達到95％以上。該方法適用各種型號高速逆流色譜儀和各種含量大豆皂苷制備。

[0026] 本發明采用優選的溶劑體系、控制實驗條件溫度(實驗條件適合溫度20～40℃，在該溫度范圍內，溫度較高時，出峰時間略有提前，分離效果變化不大，對峰形無多大影響)以及調整主機轉速和流速的工藝條件，可以高效率的分離，經一次分離后可獲得高純度的大豆皂苷A和大豆皂苷B(達到98％以上)。

[0027] 有益效果

[0028] (1)本發明制得的大豆皂苷A和大豆皂苷B能夠達到相當高的純度，甚至能直接接質譜儀等儀器。

[0029] (2)該制備方法具有操作簡便、分離效率高、分離量較大、回收率高以及重現性好、分離環境緩和以及節約溶劑的特點。

[0030] 具體實施方式

[0031] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

[0032] 實施例1

[0033] 選取乙酸甲酯—正丙醇—乙醇—水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化大豆皂苷。先按4：0.8：2：6體積比將上述溶劑組分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡30分鐘后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取100mg大豆皂苷粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為950rpm，以3.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98％以上。

[0034] 實施例2

[0035] 選取乙酸乙酯—正丁醇—乙醇—水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化大豆皂苷。實驗條件適合溫度為30℃，先按3：0.5：1：8體積比將上述溶劑組分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡30分鐘后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg大豆皂苷粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為650rpm，以3.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98％以上。

[0036] 實施例3

[0037] 選取乙酸丁酯—正丙醇—乙醇—水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化大豆皂苷。實驗條件適合溫度為22℃，先按4：1：1：6體積比將上述溶劑組分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡30分鐘后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg大豆皂苷粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為750rpm，以4.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98％以上。

[0038] 實施例4

[0039] 選取乙酸乙酯—正丙醇—甲醇—水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化大豆皂苷。實驗條件適合溫度為40℃，先按1：1：1：7體積比將上述溶劑組分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡30分鐘后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取100mg大豆皂苷粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為850rpm，以5.0ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分，得到大豆皂苷A和大豆皂苷B流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98％以上。