同田專利CN102093325A_一種高純度高車前素和澤蘭黃酮的制備方法

專利基本信息

一種高純度高車前素和澤蘭黃酮的制備方法

技術領域

[0001] 本發明屬于天然黃酮類物質制備領域，特別涉及一種高純度高車前素和澤蘭黃酮 的制備方法。

背景技術

[0002] 荔枝草（Salvia plebeia R.Br.)系唇形科鼠尾草屬植物地上部分，又名蛤蟆草、 雪見草、過冬青等。一年生或二年生直立草本植物，全國分布于除西北以外的其它地區，主 產于江蘇，浙江，安徽等省。荔枝草粗提物對CCl4和D-GlaN誘發大鼠急性肝損傷有保護作 用，Oshima等發現荔枝草中的高車前素、高車前苷和澤蘭黃酮對CCl4和D-GlaN誘發大鼠肝 細胞毒性有保護作用（lmg/kg，p < 0. OOLFerrandiz等的研究表明高車前素對溴苯誘導的 老鼠肝損傷和肝脂質過氧化有保護作用，在高劑量時對溴苯誘導的還原型谷胱甘肽缺失也 有抵抗作用，并推斷其保肝功能可能與抗氧化作用相關。曳野宏從荔枝草中分離了四種黃 酮類化合物，其中澤蘭黃酮、高車前素、高車前苷對肝中毒有顯著活性，澤蘭黃素沒有活性。 高車前苷對半乳糖胺肝細胞中毒的抑制作用也比對四氯化碳肝細胞中毒的抑制作用強。該 方法用傳統柱層析分離，成本高，重復性差，不適合規模生產。

[0003] 高車前素，澤蘭黃酮的結構式如下：

[0004]

[0005] 1 R1 = H, R2 = H ； 3 R1 = OH, R2 = H ；

[0006] 2 R1 = H, R2 = Glu ；4 R1 = OH, R2 = Glu ；

[0007] 5 R1 = H, R2 = Glc

[0008] 1高車前素3澤蘭黃酮

[0009]高速逆流色譜技術(High-SpeedCountercurrent Chromatography, HSCCC)是近 30年發展起來的一種連續的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術， 其原理是利用螺旋柱在行星式的運動時產生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時 保留其中的一相（固定相），利用恒流泵連續輸入另一相（流動相），隨流動相進入螺旋柱 的溶質在兩相之間反復分配，按分配系數的次序，被依次洗脫。在流動相中分配比例大的 先被洗脫，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脫。傳統的液相色譜技術進行制備量分 離時，分配效率低，溶劑消耗量大，而且固態支持體或載體會帶來樣品被吸附、損耗和變性 等問題；而HSCCC能保證較高峰型分辨率，具有操作簡便，分離量大，樣品無損耗，分離效率 高，理論回收率為100%，重現性好和分離環境緩和等優點，現已廣泛應用于生物、醫藥、環 保等領域化學物質的制備分離和純化。發明內容

[0010] 本發明所要解決的技術問題提供一種高純度高車前素和澤蘭黃酮的制備方法。該 方法明克服傳統分離技術的缺陷，采用高速逆流色譜法（HSCCC)制備天然異黃酮的方法， 該方法操作簡便，回收率高，分離量大。

[0011] 本發明的一種高純度高車前素和澤蘭黃酮的制備方法包括如下步驟：

[0012] (1)將A組分、B組分、C組分和D組分按體積比0.5-5 ： 0.5-5 ： 1-5 ： 2-10混 合后置于分液漏斗中，搖勻靜置分層，待平衡20-40分鐘后，將上相和下相分開，即得該溶 劑體系；其中A組分為二氯甲烷、三氯甲烷或四氯甲烷；B組分為三氯甲烷、四氯甲烷或正丁 醇；C組分為乙醇或甲醇；D組分為水；

[0013] (2)選擇上相為固定相，下相為流動相，先用固定相充滿逆流色譜儀柱子，調節主 機轉速為600-1000rpm，將流動相以0. 5-5. Oml/min的流速泵入柱內，待整個體系建立動態

平衡后，由進樣閥進樣；

[0014] (3)根據檢測器紫外圖譜接收目標成分，將流分進行濃縮、結晶，得到高車前素和

澤蘭黃酮。

[0015] 上述溶劑體系優選為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系。

[0016] 所述步驟O)中所進的樣品的制備方法為：將荔枝草提取物溶于上相和下相中。

[0017] 所述步驟（1)中的溶劑體系為二氯甲烷-三氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：0. 5 :4:3: 2;所述步驟O)中的主機轉速750rpm，流動相泵入柱內的流速 為 4. Oml/min。

[0018] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：1 :1:1: 7;所述步驟O)中的主機轉速850rpm，流動相泵入柱內的流速為 5. Oml/min。

[0019] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：4 ： 0.8 ： 4 ： 9;所述步驟O)中的主機轉600rpm，流動相泵入柱內的流速為 1. Oml/min。

[0020] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：5 ： 5 ： 4.5 ： 10;所述步驟O)中的主機轉速700rpm，流動相泵入柱內的流速 為 2. Oml/mm。

[0021] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：2 :3:1: 7 ；所述步驟O)中的主機轉速800rpm，流動相泵入柱內的流速為 3. Oml/min。

[0022] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：0. 8 :4:5: 8;所述步驟O)中的主機轉速lOOOrpm，流動相泵入柱內的流速 為 4. Oml/min。

[0023] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-乙醇-水，該四組分的體積 比依次為：0. 5 :4:2: 6;所述步驟O)中的主機轉速950rpm，流動相泵入柱內的流速 為 0. 5ml/min。

[0024] 所述步驟（1)中的溶劑體系為四氯甲烷-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：3 ： 0.5 ： 1 ： 8;所述步驟O)中的主機轉速650rpm，流動相泵入柱內的流速為 3. Oml/min。

[0025] 采用高速逆流色譜制備方法，它包括選擇構成固定相，流動相的溶解體系；先用固 定相充滿逆流色譜儀柱子，調節主機轉速，將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡 后，由進樣閥進樣；根據檢測器紫外圖譜接收目標成分。首先選擇一個溶劑體系的兩相組 合，溶劑體系由四個組分構成。

[0026] 上述體系上相為固定相，下相為流動相。且經一次分離得到高車前素和澤蘭黃酮 純品，純度在98%以上。

[0027] 實驗條件適合溫度20_40°C，在上述溫度范圍內，溫度較高時，出峰時間略有提前， 分離效果變化不大，對峰形無多大影響。

[0028] 主機轉速和流速需控制在一定范圍內，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖 勻靜置分層。待平衡一定時間后，將上相和下相分開，采用TBE-300B高速逆流色譜儀，該機 型柱體積為300ml，進樣圈為20ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。 進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為600-1000rpm，以0. 5-5. Oml/min的流 速將流動相泵入柱內。

[0029] 分離和收集到的目標成分，濃縮到一定純度后再進行結晶得到單體。高純度是指 純度彡98%。

[0030] 本發明采用了高速逆流色譜分離技術克服了固態支持物或載體不可逆吸附、損耗 和變性，使被分離物回收率高理論達100%，本發明實際達到95%以上，又因為采用優選的 溶劑體系，控制實驗條件溫度、調整主機轉速和流速的工藝條件，可以高效率的分離，獲得 高純度的高車前素和澤蘭黃酮（達到98%以上）。

[0031] 有益效果

[0032] 1、本發明采用了高速逆流色譜分離技術，保證較高峰形分辨度，分離量大、回收率 高、分離環境緩和、節約溶劑、操作簡便。

[0033] 2、本發明適合從各種工藝途徑制備的荔枝草提取物中獲得高純度的高車前素和 澤蘭黃酮（達到98%以上）。

具體實施方式

[0034] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。

[0035] 實施例1

[0036] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為25°C，先按0.5 :4:2: 6體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相 組成的溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為950rpm，以0. 5ml/min的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測 器紫外圖譜，接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC 純度達到98. 8%。

[0037] 實施例2

[0038] 選取四氯甲烷-正丁醇-乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔枝 草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為30°C，先按3 ： 0.5 ： 1 ： 8體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相溶液中 待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為650rpm，以3. Oml/min的流速將 流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜， 接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到98. 5%0

[0039] 實施例3

[0040] 選取二氯甲烷-三氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為22°C，先按0.5 :4:3: 2體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為750rpm，以4. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫 外圖譜，接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到 99. 1%。

[0041] 實施例4

[0042] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為40°C，先按1 :1:1: 7體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相溶液中 待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為850rpm，以5. Oml/min的流速將 流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜， 接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到99. 5%0

[0043] 實施例5

[0044] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為20°C，先按4 ： 0.8 ： 4 ： 9體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為600rpm，以1. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到 98. 9%。

[0045] 實施例6

[0046] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為25°C，先按5 ： 5 ： 4.5 ： 10體積比將上述溶劑 組分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為700rpm，以2. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫 外圖譜，接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到 98%以上。

[0047] 實施例7

[0048] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為32°C，先按2 :3:1: 7體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相溶液中 待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為800rpm，以3. Oml/min的流速將 流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜， 接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到98%以 上。

[0049] 實施例8

[0050] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實驗條件適合溫度為35°C，先按0.8 :4:5: 8體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為lOOOrpm，以4. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫 外圖譜，接收目標成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到 98%以上。