同田專利CN102030735B_一種高純度毛蕊異黃酮的制備方法

專利基本信息

說明書

一種高純度毛蕊異黃酮的制備方法

技術領域

[0001] 本發明屬于異黃酮的制備領域，特別涉及一種高純度毛蕊異黃酮的制備方法。

背景技術

[0002] 黃芪是多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根，性味甘溫，有補氣固表，利尿托 毒，斂瘡生肌，益氣補中之功效。主要用于食少便溏，中氣下陷，久瀉肛，便血崩漏，表虛自 汗，氣虛水腫，子宮脫垂，慢性腎炎蛋白尿，糖尿病，口久不愈合。蒙古黃芪為《中國藥典》 2005年版一部收載的正品黃芪，在《神農本草經》中列為上品。其中主要成分為毛蕊異黃 酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素和芒柄花素苷等。

[0003] 毛蕊異黃酮的結構式如下：

[0004]

[0005] 常規制備毛蕊異黃酮的方法多為反復柱層析分離，存在占地面積大，溶劑大量使 用，對環境和操作人員造成不良影響，且工藝重復性差，生產成本比較高等缺點。高速逆流 色譜技術（High-SpeedCountercurrentChromatography，HSCCC)是近 30 年發展起來的 一種連續的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術，其原理是利用螺 旋柱在行星式的運動時產生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時保留其中的一相 (固定相），利用恒流栗連續輸入另一相（流動相），隨流動相進入螺旋柱的溶質在兩相之間 反復分配，按分配系數的次序，被依次洗脫。在流動相中分配比例大的先被洗脫，反之，在固 定相中分配比例大的后被洗脫。傳統的液相色譜技術進行制備量分離時，分配效率低，溶劑 消耗量大，而且固態支持體或載體會帶來樣品被吸附、損耗和變性等問題。而HSCCC能保證 較高峰型分辨率，具有操作簡便，分離量大，樣品無損耗，分離效率高，理論回收率為100%， 重現性好和分離環境緩和等優點，現已廣泛應用于生物、醫藥、環保等領域化學物質的制備 分離和純化。

發明內容

[0006] 本發明所要解決的技術問題提供一種高純度毛蕊異黃酮的制備方法。該方法克服 傳統分離技術的缺陷，采用高速逆流色譜法（HSCCC)從豆科植物黃芪中制備天然異黃酮的 方法，該方法操作簡便，回收率高，分離量大。

[0007] 本發明的一種高純度毛蕊異黃酮的制備方法包括如下步驟：

[0008] (1)將A組分、B組分、C組分和D組分按體積比1-5 : 0? 5-2 : 1-5 : 1-8混合 后置于分液漏斗中，搖勻靜置分層，待平衡20-40分鐘后，將上相和下相分開，即得該溶劑 體系；其中A組分為乙酸甲酯、乙酸乙酯或乙酸丁酯；B組分為正丙醇或正丁醇；C組分為乙 醇或甲醇；D組分為水；

[0009] (2)選擇上相為固定相，下相為流動相，先用固定相充滿逆流色譜儀柱子，調節主 機轉速為600-1000rpm，將流動相以0. 5-5.Oml/min的流速栗入柱內，待整個體系建立動態 平衡后，由進樣閥進樣；

[0010] ⑶根據檢測器紫外圖譜接收目標成分，將流分進行濃縮、結晶，得到毛蕊異黃酮。

[0011] 上述溶劑體系優選為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水體系。

[0012] 所述步驟（2)中的所進的樣品的制備方法為：將黃芪提取物溶解于上相和下相 中。

[0013] 所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丙醇-甲醇-7K，該四組分的體積比依 次為：1 : 1 : 1 : 7;所述步驟（2)中的主機轉速850rpm，流動相栗入柱內的流速為5.Oml/ min〇

[0014] 所述步驟（1)中的溶劑體系為乙酸甲酯-正丙醇-乙醇-水，該四組分的體積比 依次為：4 : 0. 8 : 2 : 2;所述步驟（2)中的主機轉速950rpm，流動相栗入柱內的流速為 3.Oml/min〇

[0015] 所述步驟（1)中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比 依次為：3 : 0. 5 : 1 : 8;所述步驟（2)中的主機轉速650rpm，流動相栗入柱內的流速為 0? 5ml/min〇

[0016] 所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-7K，該四組分的體積比依 次為：1 : 2 : 4 : 5;所述步驟（2)中的主機轉速600rpm，流動相栗入柱內的流速為1.0ml/ min〇

[0017] 所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-7K，該四組分的體積比依 次為：2 : 1 : 4 : 2;所述步驟（2)中的主機轉速700rpm，流動相栗入柱內的流速為2.Oml/ min〇

[0018] 所述步驟（1)中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比 依次為：5 : 0. 5 : 3 : 8;所述步驟（2)中的主機轉速800rpm，流動相栗入柱內的流速為 3. Oml/min〇

[0019] 所述步驟（1)中的溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比 依次為：3 : 1 : 5 : 4;所述步驟（2)中的主機轉速lOOOrpm，流動相栗入柱內的流速為 4. Oml/min〇

[0020] 所述步驟⑴中的溶劑體系為乙酸丁酯-正丙醇-乙醇-7K，該四組分的體積比依 次為：4 : 1 : 1 : 6;所述步驟（2)中的主機轉速750rpm，流動相栗入柱內的流速為4.Oml/ min〇

[0021] 根據溶解度常數，在不破壞體系平衡的情況下，調節A，B，C，D四組分的體積比例。

[0022] 高純度是指純度多98% ;且經一次分離得到毛蕊異黃酮純品，純度在98%以上。 分離和收集到的目標成分，濃縮到一定純度后再進行結晶得到單體。

[0023] 主機轉速和流速需控制在一定范圍內，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖 勻靜置分層，待平衡一定時間后，將上相和下相分開；進樣前，先用固定相充滿整個柱子，流 動相栗入柱內。

[0024] 實驗條件適合溫度20-40°C，在上述溫度范圍內，溫度較高時，出峰時間略有提前， 分離效果變化不大，對峰形無多大影響。

[0025] 調整主機轉速為600-1000rpm，以0? 5-5.Oml/min的流速將采用TBE-300B高速逆 流色譜儀，該機型柱體積為300ml，進樣圈為20ml，配有TBP-50A栗，TBD-23檢測器和N2000 色譜工作站。

[0026] 采用高速逆流色譜制備方法，它包括選擇構成固定相，流動相的溶解體系；先用固 定相充滿逆流色譜儀柱子，調節主機轉速，將流動相栗入柱內；待整個體系建立動態平衡 后，由進樣閥進樣；根據檢測器紫外圖譜接收目標成分。

[0027] 本發明采用了高速逆流色譜分離技術克服了固態支持物或載體不可逆吸附、損耗 和變性，使被分離物回收率高理論達100%，本發明實際達到95 %以上，又因為采用優選的 溶劑體系，控制實驗條件溫度、調整主機轉速和流速的工藝條件，可以高效率的分離，獲得 高純度的毛蕊異黃酮（達到98%以上）。

[0028] 有益效果

[0029] 1、本發明采用了高速逆流色譜分離技術，保證較高峰形分辨度，分離量大、回收率 高、分離環境緩和、節約溶劑、操作簡便。

[0030] 2、本發明適合從各種工藝途徑制備的黃芪提取物中獲得高純度的毛蕊異黃酮 (達到98%以上）。

具體實施方式

[0031] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。

[0032] 實施例1

[0033] 選取乙酸甲酯_正丙醇_乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為20°C，先按4 : 0.8 : 2 : 2體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取lOOmg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相組成的溶 液中待用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為950rpm，以3.Oml/min的流 速將流動相栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖 譜，接收目標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到98. 8%。

[0034] 實施例2

[0035] 選取乙酸乙酯_正丁醇_乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為30°C，先按3 : 0.5 : 1 : 8體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待 用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為650rpm，以0. 5ml/min的流速將流 動相栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接 收目標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮后進行結晶，其HPLC純度達到98. 9%。

[0036] 實施例3

[0037] 選取乙酸丁酯_正丙醇_乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為22°C，先按4 : 1 : 1 : 6體積比將上述溶劑組分分配 置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型 逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23檢 測器和N2000色譜工作站。稱取150mg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。 進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為750rpm，以4.Oml/min的流速將流動相 栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目 標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98. 5%。

[0038] 實施例4

[0039] 選取乙酸乙酯_正丙醇_甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為40°C，先按1 : 1 : 1 : 7體積比將上述溶劑組分分配 置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型 逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23檢 測器和N2000色譜工作站。稱取lOOmg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。 進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為850rpm，以5.Oml/min的流速將流動相 栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目 標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到99. 1 %。

[0040] 實施例5

[0041] 選取乙酸乙酯_正丁醇_乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為25°C，先按1 : 2 : 4 : 5體積比將上述溶劑組分分配 置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型 逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23檢 測器和N2000色譜工作站。稱取150mg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。 進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為600rpm，以1.Oml/min的流速將流動相 栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目 標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98%以上。

[0042] 實施例6

[0043] 選取乙酸乙酯_正丁醇_乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為28°C，先按2 : 1 : 4 : 2體積比將上述溶劑組分分配 置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型 逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23檢 測器和N2000色譜工作站。稱取150mg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。 進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為700rpm，以2.Oml/min的流速將流動相 栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收目 標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98%以上。

[0044] 實施例7

[0045] 選取乙酸乙酯_正丁醇_乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為35°C，先按5 : 0.5 : 3 : 8體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待 用。進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為800rpm，以3.Oml/min的流速將流 動相栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接 收目標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98%以上。

[0046] 實施例8

[0047] 選取乙酸乙酯_正丁醇_乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化黃芪 毛蕊異黃酮。實驗條件適合溫度為32°C，先按3 : 1 : 5 : 4體積比將上述溶劑組分分配 置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開。采用半制備型 逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A栗，TBD-23檢 測器和N2000色譜工作站。稱取150mg黃芪粗樣溶解于10ml上相和10ml下相溶液中待用。 進樣前，先用固定相充滿整個柱子，調整主機轉速為lOOOrpm，以4.Oml/min的流速將流動 相栗入柱內；待整個體系建立動態平衡后，由進樣閥進樣，然后根據檢測器紫外圖譜，接收 目標成分，得到毛蕊異黃酮流分，濃縮凍干后進行結晶，其HPLC純度達到98%以上。